上海酶聯生物PCR試劑盒實驗的注意事項，我司作為一家立志于為人類生命健康事業貢獻力量的試劑生產型企業，產品名稱依舊“不忘初心、胸懷大愛"，以守護節能、健康的環境為己任！

PCR實驗要注意以下幾點：

1. PCR引物設計：

引物設計可能是PCR擴增成功zui關鍵的因素。如引物設計欠佳，可能導致擴增產物不足，甚至擴增失敗，其原因是設計欠佳的引物可導致非特異擴增和/或形成引物二聚體，此又成為PCR反應的競爭性產物，從而進一步抑制PCR產物形成。

在引物設計時必須考慮以下幾個因素，其中zui重要的是引物長度、溶解溫度（Tm）、特異性、引物序列互補問題、G/C 含量和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸、3’-末端序列等。 

（1）引物長度：由于PCR反應的特異性、退火溫度以及時間均至少部分與PCR引物長度相關聯，因此引物長度是PCR擴增是否成功關鍵的因素。一般PCR引物長度為15-30核苷酸。

（2）溶解溫度（Tm）：因加熱而斷開H鍵，使雙鏈DNA分開或“溶解"為單鏈DNA。溶解溫度（Tm）即指使一半雙鏈DNA變為單鏈DNA的溫度。Tm可采用下列公式計算：Tm＝2（A+T） + 4（G+C）。

需注意PCR反應至少有兩個（一對）引物，兩個寡核苷酸引物Tm 值應比較接近，不可差異過大。因有較高的Tm值的引物在較低的反應溫度時可發生錯配，而引物Tm值較低，反應溫度較高時則可能不能發生作用，因此如引物的Tm值差異較大，可導致PCR擴增效率低下甚至擴增失敗。

（3）引物序列互補：設計引物時應沒有3個堿基以上的內引物配對，如引物有這樣具有自我配對的區域，“彈回"即部分雙鏈結構將發生在退火反應時。

（4）G/C 含量和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸：待選擇的引物序列應盡可能是堿基隨意分布，G+C含量平均-避免長A+T和富含G+C的區域。在引物的堿基組成中GC含量一般為45％-55％。在選擇的引物序列中應沒有多G 或多C延伸，因其可促進非特異性退火，多A 和多T延伸也應避免，因其可“呼吸"和使引物－模板復合物展開延伸，降低擴增的效率。同時多嘧啶（T,C）和多嘌呤（A,G）延伸也應被避免。 

（5）3’-末端序列：為控制引物錯配，應認真地確定PCR引物中3’末端的位置。

總而言之，應重視PCR引物設計，設計PCR引物時應認真小心。對于一個成功的PCR來說，幾個重要因素如引物長度、GC含量和3’序列必須優化。理想的引物應為差不多隨意分布的核苷酸混合、GC含量50％、長度約為20個堿基，因此能使Tm值處于56-62oC范圍。分析靶基因潛在引物位點時，應考慮無單聚合體, 沒有明顯的二級結構形成的傾向，不自我互補，與其他雙鏈靶基因序列沒有明顯的同源性。為避免枯燥無味的設計，節省時間，減少錯誤，可應用計算機程序優化設計、選擇、確定寡核苷酸引物。

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